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Carlos Eduardo Gusi, Catiane Pelissari, Andrei de Jesus Rodrigues, Cesar Milton Baratto
Constructed wetlands are an ecological technology that aims to treatwater pollution, presenting great advantages, such as high resistance to environmental changes, simplicity in the construction process and low maintenance cost. To monitor their performance, PCR-based techniques have been widely used, however, nucleic acids quantity and quality can be limiting factors in their use. Objective of this research was to evaluate and optimize methods for simultaneous extractions of RNA and DNA from environmental samples, such as wetland systems. Samples for nucleic acids extraction were collected from the active wetlands system. These were treated to separate and collect microorganisms films. Extraction technique was based on the method with the trizol reagent from two factures. The parameters were regarding the use of glass beads, variation in reagent concentration, addition of DEPC water to the sample and the precipitation DNA method. Extraction efficiency evaluation, as quantitative and qualitative, was based on analyzes using a spectrophotometer, conventional PCR and RT-PCR, carried out by agarose gel electrophoresis, and by qPCR. Results demonstrated that glass beads use increased significantly efficiency extractions, while the addition of DEPC water behaved differently for the reagents, making it possible to obtain up to 42 ng/μL of RNA and 15 ng/μL of DNA with a good quality. Specifically in DNA extraction, the new method applied in its precipitation with pH correction proved to be significantly more efficient. Analyzes using conventional PCR and RT-PCR on extraction products, as well as qPCR, confirmed the previous data, and the quantity and quality of the extracted DNA and RNA allow their use in the respective techniques. We conclude that an optimized methodology developed for the simultaneous obtaining of RNA and DNA has improved efficiency, making it possible to use on microorganisms monitoring of the wetland treatment system.
Wetlands construídos é uma tecnologia ecológica que visa tratar a poluição de águas, apresentando grandes vantagens, vide a alta resistência as alterações ambientais, simplicidade no processo de construção e um baixo custo de manutenção. Para o acompanhamento de seu desempenho, técnicas baseadas em PCR vem sendo amplamente empregadas, entretanto, a quantidade e a qualidade dos ácidos nucleicos podem ser um fatores limitantes na sua utilização. O objetivo da presente pesquisa foi de avaliar e otimizar métodos para extração simultânea de RNA e DNA a partir de amostras ambientais como de sistema wetland. As amostras para dos ácido nucleicos foram coletadas do sistema wetlands em funcionamento. Estas foram tratadas para suspensão dos filmes e coleta do microrganismos. A técnica de extração foi baseada em método com o reagente trizol oriunda de duas empresas. Os parâmetros foram quanto a utilização de pérolas de vidro, variação na concentração do reagente, adição de água DEPC na amostra e na forma de precipitação do DNA. A avaliação da eficiência das extrações, tanto quantitativa como qualitativa, foi a partir de análises em espectrofotômetro, PCR e RT-PCR convencional, sucedido por eletroforese em gel de agarose, e por qPCR. Os resultados demonstraram que a utilização de pérolas de vidro aumentaram significativamente a eficiência das extrações, enquanto a adição de água DEPC se comportou de maneira diferente para os reagentes, sendo possível obter até 42 ng/μL de RNA e 15 ng/μL de DNA e de boa qualidade. Especificamente na extração de DNA o novo método aplicado na sua precipitação com correção de pH, mostrou-se significativamente mais eficiente. As análises utilizando os produtos das extrações em PCR e RT-PCR convencional, assim como de qPCR, confirmaram os dados anteriores, sendo que a quantidade e a qualidade do DNA e RNA extraídos permitem sua utilização nas respectivas técnicas. Concluí-se que a metodologia otimizada desenvolvida para a extração simultânea de RNA e DNA possui eficiência melhorada, sendo possível sua utilização no acompanhamento da população de microrganismos em sistema de tratamento por wetland.
